Вы находитесь:

Анализ клеточной культуры млекопитающих с помощью автоматических биохимических анализаторов

Harlan Polishook. Rapid Monitiring of Mammalian Cell Culture.// Genetic Engineering. Vol. 20, March 1, 2000.

В биотехнологическом производстве используются принципы, основанные на фундаментальных научных исследованиях. Однако при работе с культурами клеток знания общеизвестных фундаментальных закономерностей недостаточно. Часто существует нехватка адекватных данных о состоянии культуральной среды и клеток.
Это обычно вызвано ограничением во времени разработки производственного процесса или допущением того, что относительно небольшое количество параметров могут быть подобраны заменой среды, содержанием кислорода и уровнем pH. 
На ранних стадиях разработки технологического процесса мониторинг количества питательных веществ, метаболитов или газов необходим для того, чтобы установить базисную линию измерений или определить возможные ограничения процесса. Один раз установленные, эти параметры могут обеспечить принципиальную схему процесса с высокими выходами целевого продукта при масштабировании до пилотных и производственных уровней.

Культуры клеток млекопитающих
Эта статья посвящена культуре клеток млекопитающих и ключевым биохимическим параметрам, которые необходимо контролировать при работе с ними. Для этих целей необходимо оборудование, которое позволяет быстро, в режиме реального времени отслеживать эти параметры.
Так как клетки млекопитающих очень чувствительны к изменениям окружающей среды, контроль скорости их роста чрезвычайно важен. Клетки млекопитающих обычно культивируются в ферментационных колбах или биореакторах в периодическом режиме, с подпиткой или непрерывном.
В каждом случае культуральная среда содержит соли, аминкислоты, витамины, факторы роста и глюкозу. В ходе культивирования дополнительное введение питательных веществ может обеспечить оптимальные условия роста, в то время как уровень других параметров может говорить о необходимости скорректировать состав питательной среды.

Контроль ключевых биохимических параметров
Рост клеток, уровень метаболитов и экспрессии белков подвержены изменению pH, уровень которого контролируется добавлением углекислого газа или соответственно основания. Уровень растворенного кислорода может быть увеличен добавлением воздуха или барботированием кислородом.
Глюкоза и глутамин являются главными источниками энергии, запас которых необходимо пополнять. Лактат и аммоний могут воздействовать на жизнеспособность клеток при высоких концентрациях. Аммоний также может воздействовать на гликозилирование белка. Следует ограничивать растворение углекислого газа во избежание ингибирования роста клеток и экспрессии белка.
Множество методов контроля в режиме реального времени и «оф-лайн» используются в настоящее время, включая измерение pH , контроля уровня растворенных газов и различные ферментативные методики для определения концентрации метаболитов и питательных веществ. Однако все эти методы не застрахованы от возможного дрейфа относительно градуировочной кривой, человеческих ошибок и/или задержки в получаемых отчетах.

Современные биосенсорные технологии
Недавно компания Nova Biomedical (Waltham, MA) представила новый анализатор BioProfile, базирующийся на запатентованной биосенсорной технологии, первоначально использующейся для определения газов крови в медицинских лабораториях.
Химический анализатор BioProfile предназначен для быстрого, экономичного анализа в режиме он-лайн ключевых питательных веществ, метаболитов и газов в культуральной среде. В биосенсорах, установленных на приборах BioProfile используются как потенциометрические электроды (pH, pCO2, NH4+, Na+, K+, Ca2+), так и амперометрические (pO2, глюкоза, лактат, глутамин, глутамат).
Потенциометрические электроды измеряют заряженные ионы и имеют мембрану, селективную к измеряемому иону. Разность потенциалов на мембране прямо пропорциональна концентрации ионов. Потенциал может быть описан уравнением Нернста:
E = Eo + 2.303 RT/nF log ai

Основа амперометрического электрода – электрод, который состоит из кислородно-проницаемой мембраны, покрывающей платиновый катод с постоянным потенциалом. Кислород проникает через мембрану, в результате чего катод, принимая электроны, восстанавливается. Изменение заряда тока прямопропорционально концентрации кислорода в образце.
Биосенсоры на глюкозу, лактат, глутамин представляют собой амперометрические электроды с иммобилизованными на их поверхность ферментами. В присутствии кислорода и измеряемого субстрата под действием соответствующих ферментов образуется пероксид водорода, который окисляется на платиновом аноде при постоянном напряжении. Образующийся поток электронов и, соответственно, сила тока пропорциональна концентрации образца.

Рисунок 1. Биосенсоры на глюкозу – амперометрические электроды с иммобилизованными на их поверхность ферментами

Многофункциональность анализатора
Установленные в биосенсорах пределы измерения отвечают всем требованиям при работе с культурами клеток млекопитающих. Химические анализаторы BioProfile предоставляют информацию, которая необходима для понимания и контроля процессов, связанных с клеточной культурой.
Многофункциональные анализаторы BioProfile могут заменить до шести приборов, тем самым снижая капитальные вложения и затраты на измерения, при этом обеспечивая точные результаты в течение двух минут. Система анализатора позволяет работать с образцами без дополнительной пробоподготовки и центрифугирования, отбирая пробы из шприцов, пробирок, кювет или пипеток.

Рисунок 2. Химические анализаторы BioProfile могут заменить до 6 аналитических приборов, снижая капитальные вложения, и затраты на расходные материалы

Образцы измеряются при 37°С во избежание изменения таких параметров как pH. Приборы BioProfile комплектуются 40-позиционным автоматическим сэмплером.

Автоматизация прибора
Анализаторы BioProfile полностью автоматизированы и предназначены для использования оператором с минимальным уровнем подготовки. После нажатия кнопки «ANALYZE» образцы автоматически аспирируются, и конечные результаты представляются без последующих вмешательств оператора. На мониторе оператора отображается статус состояния пробы с момента аспирации и до получения результатов. Автоматическая система сигнализирует оператору о любых отклонениях от нормального протекания процесса.

Сравнение результатов, полученных с помощью BioProfile с результатами других химических анализаторов
Полученные результаты могут отображаться на дисплее или распечатываться на встроенном принтере. Также может быть запрограммирована функция об автоматическом оповещении оператора об отклонении определенного параметра за заданные границы.
Результаты, полученные с помощью BioProfile отлично коррелируют с результатами, полученными с помощью других общепринятых методов, например: ферментативный анализатор аммония компании Roche/Boehringer Mannheim; YSI Inc. 2700 Select Dual Channel Analyzer (глюкоза, лактат, глутамин, глутамат); Precision Systems Inc. MultiOsmette Model 2430 (осмотическое давление); анализатор Chiron для измерения pH, pO2 и pCO2.


Рисунок 3. Коэффициент корреляции (R2) между результатами, полученных с помощью BioProfile 400 и ферментативным анализатором аммония Roche/Boehringer составляет 0.99

Прямой отбор проб из биореактора
Для прямого отбора проб доступен он-лайн автосэмплер, который может быть соединен одновременно к четырем реакторам. Частота отбора проб устанавливается оператором с помощью приставки Nova Biomedical Data Manager (BDM). Все результаты сохраняются и могут быть, затем проанализированы. Автосэмплер сконструирован для обеспечения сохранения полной стерильности биореактора.

Вернуться »

Abercade — Исследования промышленных рынковBiOENGiNEERiNGТРИС