Вы находитесь:

Феномены совместной метаболической и осмотической регуляции роста бактерий

(описание прибора)

Abstracts

 В процессе  роста бактерий  были  обнаружены  феномены  совместного изменения  их среднего размера (HMS)  и  концентрации  ионов в клеточной  цитоплазме (CIC). Рассмотрена связь этих параметров  с регуляцией метаболической активности клеток, которая   может иметь  при интенсивном росте  периодический  характер.  Обнаружены  особые точки  совместного изменения  метаболической  активности  и осмотической регуляции. Для определения  СIC и HMS использованы online результаты электрооптического анализа  суспендированных клеток в среде с низкой электропроводностью. Как пример приведены  результаты исследования ростка   клеток  Еcoli K12 c  аэробным  типом метаболизма и клеток  L plantarum с анаэробным типом метаболизма  

  Introduction

 Метаболизм бактерий  является базисом  биотехнологических процессов  и  используется  при решении множества научных  и прикладных задач/1/. Основная часть приложений связана с оптимальным, сбалансированным и воспроизводимым ростом клеток.  Однако выполнение каждого из условий и их совокупности  дается с трудом.    

Для  многих видов бактерий центральным процессом катаболизма энергетических  субстратов  является  гликолиз /2/. Помимо основного метаболического пути  существует несколько  дополнительных аплеротических   путей,  которые бактерии могут использовать  при интенсивном росте для стабилизации  своего биохимического состояния.  При активизации этих путей   клетки  либо создают  недостающие  соединения,  либо получают дополнительную  энергию. Однако часто при этом образуются  токсичные метаболиты /3,4/.

К сожалению online мониторинг  роста бактерий  и анализ  регуляции  метаболической активности по основному и дополнительным путям  может быть проведен  только по внешним признакам,  ограниченному набору параметров и с задержкой во времени. Отдельные детали  метаболической активности  исследованы известными  методами по изменению концентрации  компонент  питательной среды, метаболитов, изменению рН,  респираторной  активности и по ряду других параметров. Однако  набор  этих параметров оказывается недостаточным и ряд важных моментов процесса регуляции остается в тени.

Использование метода  электрооптического  анализа бактериальных суспензий   позволило оценить изменение  специфической метаболической активности статистически усредненной клетки. В основе электрооптического метода  лежит  фотометрический метод измерения вариаций оптических свойств суспензии после воздействия на нее электрического поля /5/. Этот метод измерений является прижизненным. Он не используют дополнительных меток или химических компонент  и не вызывают изменений в исследуемом объекте.   Индуцированные электрическим полем  заряды образуются на границах  клеточных структур. Их величина  зависит от отношения электрических свойств соприкасающихся структур /6,7/. Частным  случаем измерений, который представляет особый интерес,   является  определение электропроводности цитоплазмы на поверхности контакта с мембраной. Взаимодействие  зарядов с полем приводит к незначительному изменению ориентации клеток в поддерживающей среде.  Изменение ориентации проявляется в изменении оптических свойств суспензии и может быть измерено с высокой точностью /8/. 

В электрооптических экспериментах с периодическим  и непрерывным культивированием  бактерий  различных видов были обнаружены ранее не исследованные феномены  совместного изменения  концентрации ионов  в цитоплазме, которые отражают метаболическую активность клеток и осмотического состояния клетки. Показателем осмотического состояния  клетки  является  HMS.

Обнаружены  особые точки  регуляции,  в которых  клетки производят  резкое изменение  метаболической  активности. 

 Results

 На  рис.1 представлены основные детали электрооптической методики, которая используется для анализа суспендированных бактерий.

 

Рис.1 Схема  электрооптического методики  исследования  суспендированных бактерий

Электрооптический метод определяет анизотропию клеток (АР)  через изменение оптической плотности суспензии после действия на нее  переменного электрического поля. Наши измерения показали, линейная зависимость между изменением оптической плотности и АР существует при напряженности электрического поля в измерительной ячейки менее, чем 100 V/cm. Мы используем линейную зависимость между АР, как первичным физическим параметром, электропроводностью цитоплазмы и  концентрацией в ней ионов (СIC). При частоте электрического поля  в диапазоне  500 – 800 kHz имеется линейная зависимость между   АР  и  электропроводностью цитоплазмы . Электропроводность цитоплазмы представляет собой сумму   произведений концентрации присутствующих  ионов на их подвижность /9/.  В каждый момент времени электропроводность цитоплазмы  пропорциональна СIC,  которая включает в себя  ионы как промежуточной, так и конечной стадий всех биохимических реакций.

Цитоплазма обладает большой буферной емкостью и в ней присутствуют  различные виды ионов.  Для клеток каждого вида существует  определенный уровень  СIC, который  отражает состояние покоя.  Превышение этого уровня свидетельствует о  метаболической активности клеток  и связано с увеличением концентрации  диссоциированных метаболитов,  осмотических протекторов  и ионов, связанных с энергетическим статусом /9/.  К числу таких ионов  можно отнести фосфатные ионы,  Н+  и другие макроэргические диссоциированные соединения.

Анализ релаксационной части изменения оптической при переходе клеток из ориентированного в хаотическое состояние  позволяет   выполнить гидродинамическую оценку  среднего размера  (HMS)   и распределение размеров  W(b), где b-текущий размер /10/. Релаксация клеток из ориентированного в хаотическое состояние описывается экспоненциальной функцией.  Экспоненциальный множитель пропорционален объему клеток и  вязкости среды, а весовой множитель пропорционален концентрации клеток. Для гетерогенной суспензии  полный сигнал состоит из  суммы сигналов от гомогенных фракций.  Площадь под релаксационной кривой  представляет собой   HMS клеток.  Известны аналитические соотношения, которые связывают  HMS  с  размером  клеток /11/. Для точного расчета размера каждого вида микроорганизмов  в эти соотношения необходимо вводить корректирующие коэффициенты /12 /.  Для их  определения  могут быть использованы  результаты калибровки независимыми методами, например микроскопический анализ размеров клеток.  Однако  более часто используется  анализ относительного  изменения  размера, которые  HMS отражает с  уникальной точностью и калибровка не требуется. 

Мы можем сравнить две релаксационные  кривые  A1(t), A2(t) и изменить интерполяцией  экспериментальных данных временную шкалу  a одной из них, например  A2(a*t).  Тогда малая невязка (сумма среднеквадратичных отклонений  ) между ними для некоторой величины  a  будет воспроизводить неизменность формы распределения размеров,  а большая невязка- для всех значений  a отражать изменение формы W(b). Временная шкала  a  для малой невязки воспроизводит в этом случае  пропорциональной изменение размера каждой фракции гетерогенной смеси. Этот метод будет использован для селекции- что изменилось:  временная шкалаe a  или форма распределения размеров  W(b).

    Регуляция  роста клеток  EColi  K12 при периодическом  аэробном культивировании

На рис 2   представлены  профили  оптической плотности  (OD),  СIC, HMS, скорости измерения концентрации ацетата  в процессе периодического культивирования  клеток   Ecoli K12  и профили  OD,  СIC и  HMS в режиме турбидостат

 

 

Рис.2  Изменение зависимости  (OD),  MIC, HMS, концентрации ацетата и глюкозы в процессе периодического культивирования  клеток   Ecoli K12 и режиме турбидостат . Вместо СIC здесь и далее использована  величина AP, которая отображается  прибором и связана с абсолютной величиной АР  множителем  5*10-23 Ф*м.  

 

Наши измерения показывают, что абсолютная величина CIC стартовой культуры  для  клеток каждого вида должна лежать в определенном диапазоне величин. Если клетки имеют  значение CIC ниже  границы диапазона, то обычно это является показателем  их  сильного ингибирования.  Если значение CIC лежит выше  границы диапазона,  то это, как будет подробно рассмотрено  ниже,  указывает  на присутствие  в клетке  метаболитов. Как первый, так и второй случай являются нежелательными для  нормального старта периодического культивирования клеток.      

После инокуляции   начинается активный рост, который сопровождается  в данном случае  совместным увеличением  CIC и HMS клеток. Основной  катаболический процесс аэробных микроорганизмов обычно  включает в себя гликолиз и цикл трикарбоновых кислот.  Известно, что бактерии  наряду  с основным процессом клетки используют дополнительные аплеротические  реакции /13/.  Для  аэробных клеток  одной из типичных аплеротических реакций является  преобразование  пирувата  в  ацетат с получением энергии /14,15,16/. Дополнительной  причиной возникновения этого пути также считают  ограниченную производительность цикла Кребса /17/. Концентрация  ацетата в культуральной среде до 80 мин роста является низкой и возможно его  часть удаляется из клетки  пассивным транспортом. Однако этот процесс  существенно не влияет на скорость накопление ацетата  и его парциальное давление в цитоплазме возрастает.

Изменение CIC сопровождает этот процесс и может быть связано как с изменением  концентрации частично дисcоциированного ацетата  и возможно других не исследованных диссоциированных метаболитов , так и  с появлением различных осмотических протекторов. Одним из общеизвестных осмотических протекторов   являются  ионы К+, которые  находятся в цитоплазме в свободном состоянии или образуют   защитные  ленточные структуры вокруг белков /18,19/.  Связь между увеличением  в цитоплазме концентрации этих ионов  и величины МИК является очевидной.  

Повышенное осмотического давления  в бактериях при накоплении метаболитов  уменьшается за счет увеличением  объема внутриклеточной воды и их разбавления.  Увеличение  HMS  клеток подтверждает существование   этого процесса.  Анализ формы релаксационной кривой позволяет утверждать, что изменяется  только  time scale  a, а форма  W(b) остается неизменной. Источниками  воды  могут быть  как  внешняя среда, так и биохимические реакции. Известно, что  при  высокой  метаболической активности клеток  увеличение размера клеток связано главным образом c накоплением воды в цитоплазме за счет  биохимических реакций /20/.

Максимум  CIC при времени роста 80 мин отражает особую точку  (switch) регуляции  метаболической активности клеток, однако на кривой изменения оптической плотности эти события проявляются незначительно.  Концентрация ацетата и/или сопутствующих токсичных метаболитов  в этот момент превышает критический порог. Клетки производят  его  экстракцию(эвакуацию),  как единственный путь защиты. Возможно, что в этой области  пассивный транспорт  наружу затрудняется  за счет выравнивания концентрации  ацетата в среде и в клетке. В этом случае увеличение скорости  накопления ацетата  также будет снижать метаболическую активность клеток. Согласно  закона Нернста  трансмембранный потенциал  связан с отношение абсолютных концентраций  ацетата  снаружи и внутри клетки/21/.  Поэтому  точка достижения максимума  концентрации ацетата  в цитоплазме и прекращения его пассивного транспорта  будет зависеть от энергетического статуса  клетки и может изменяться от одного роста к другому.  

Снижение  CIC  после точки  максимума  отражает  уменьшение  концентрации в цитоплазме ацетата и снижение его парциального давления  как за счет его транспорта наружу, так и за счет снижения  метаболической  активности.  Этот процесс сопровождается  уменьшением  концентрации  протекторов осмотического давления  и  уменьшением  объема воды в цитоплазме. С небольшой задержкой во времени  график HMS воспроизводит  снижение объема клеток за счет уменьшения  воды в цитоплазме. Как и ранее,  форма  W(b) остается неизменной, а изменяется только  time scale  a.  Наиболее вероятно, что ацетат и K+ переносится из клетки  активным транспортом, в то  время  как  перенос воды  и других осмотических протекторов  производится пассивно/22/. 

Появление следующей особой точки изменения  CIC связано с новым этапом регуляции и происходит при  приближении  клеток к стационарной области роста.  В этот момент  либо  снижение концентрации ацетата  и сопутствующих метаболитов в цитоплазме  снимает ограничение на  метаболическую активность, либо их концентрации снаружи и внутри выравниваются . Клетки повышают свою активность.  Энергетический статус клеток и концентрация сопутствующих ионов растет.  Концентрация  ацетата также  начинает возрастать, но после непродолжительного времени  активность клеток снижается и скорость образования  ацетата падает.

Далее  процессы снижения  концентрации ацетата и увеличения метаболической активности могут чередоваться. Однако первый из этих процессов является  доминирующим и с каждым новым циклом  CIC  и HMS  клеток  снижаются все больше и больше. С определенной  стадии стационарного процесса роста  причиной изменения HMS становится не только изменение  time scale  a, но и формы  W(b).  Этот феномен  связан с исчезновением   необходимых для деления или роста  клеток компонент питательной среды /23/.

После  исчерпания  энергетического субстрата- глюкозы периодические процессы прекращаются. Однако, иногда  на  стадии  дальнего стационара  наблюдается резкий спад CIC без изменения HMS. Наиболее вероятным объяснением  является выполнение клеткой  последнего шага удаления метаболитов, который  сопровождается ее энергетическим истощением.       

Сравнение  величины  CIC  и  HMS  на  двух склонах  кривой позволяет получить дополнительную информацию об изменении состояния клеток.   Если предположить, что процессы  осмотической регуляции происходят по одному сценарию для  стадии накопления ацетата и  для его удаления, то сравнение  величин CIC при одинаковых величинах  HMS  позволяет определить изменение в клетках концентрации других видов ионов. Наиболее вероятно, что  в этом случае изменяется концентрация  ионов энергетического статуса.  Отрицательная разность  уровней CIC  левого и правого склона  экспериментальной кривой при этом предположении прямо отражает  снижение энергетического статуса клеток на  стационарной стадии роста. 

Как следует из графиков режима турбидостат,  после  перехода  клеток в стационарное состояние    величины CIC и  HMS могут оставаться неизменными длительное время. Установка  уровня  CIC  в режиме  турбидостат  фактически определяет  допустимую  концентрацию в клетке токсичного метаболита, эффективность и надежность метаболической активности клетки.

Через  некоторое время после прекращения регулирования  величины OD  поведение функций  CIC и HMS полностью повторяет детали процесса регулирования  на стационарной фазе batch культивирования клеток

 Регуляция  роста клеток L.plantarum при периодическом анаэробном культивировании

 На рис. 3  представлены зависимости  CIC АP, HMS  и изменение оптической плотности  L. plantarum  в процессе периодического культивирования.

 

Рис. 3 Изменение  MIC, HMS  и  оптической плотности  бактерий L. plantarum  в процессе периодического культивирования.

Как известно, метаболические пути  анаэробных лакто бактерий имеют  более простую структуру в сравнении  факультативным микроорганизмами EColi /24/.  Стартовое состояние клеток, начальная и стационарная  фазы роста  для  этих двух видов клеток  имеют  много общих черт,  что связано с идентичностью процесса гликолиза  вплоть до стадии образования пирувата /25,26/. Различия в метаболических путях и методах регуляции проявляются главным образом после достижения  в клетках порогового уровня  лактата, которым в данном случае предполагается  основным метаболитом.  Этот процесс не имеет столь драматических последствий,  как достижение порогового уровня ацетата в клетках EColi.  Приведенные  данные  культивирования  L. plantarum  включает в себя  три явных цикла  регулирования и три точки переключения метаболических процессов, которые  отражаются в графиках CIC и HMS. Каждый из циклов включает стадию удаления метаболитов и стадию возобновления метаболической активности.  В зависимости от начальных условий и состояния культуры эти процессы  могут происходят  как с последовательным увеличением  абсолютной величины CIC от точки переключения к точке переключения, так и с ее уменьшением. Количество циклов может изменяться в зависимости от интенсивности процесса, стартовых условий  и состава питательной среды.

 На рис. 4  представлены профили  CIC  и HMS  для нескольких подобных процессов периодического культивирования и одного процесса с неблагоприятной стартовой культурой.

 Рис.4  Воспроизводимость профилей  CIC  и HMS  для нескольких подобных  процессов и  одного неблагополучного процесса периодического культивирования бактерий L. plantarum 

 Совпадение  последовательности  и абсолютной величины деталей профилей  CIC  и HMS  отражает  полную идентичность процессов метаболизма  клеток в трех процессах роста.   Сопоставление различных профилей процессов позволяет связать отклонение процесса от  стандартного профиля с фазой роста клеток и  идентифицировать его причину. Этот метод может быть эффективно использован для мониторинга и оптимизации  масштабирования  процессов культивирования.     

Discussion

 Измерение    СIC и  HMS  бактериальных клеток является мощным и эффективным инструментом для online анализа метаболической активности  клеток .  Так как   электрооптические измерения оперируют с прямыми измерениями явных физических параметров  статистически средней клетки,  то для  данного типа измерений отсутствует проблема  нормировки параметров. В тоже время  изменение морфометрической гетерогенности популяции может быть выполнено простым и эффективным способом по изменению формы релаксационной  кривой.          

Процесс роста различных типов клеток  образует уникальные  и воспроизводимые профили  СIC и  HMS.    Каждый из этих профилей  может быть разделен на  области, в которых клетки осуществляют регуляцию метаболической активности предсказуемым и прогнозируемым путем.  Детальный анализ  изменения параметров в этих областях позволяет  идентифицировать  процессы биохимической активности и  осуществить  оптимальный и  сбалансированный рост клеток.

Наиболее интересными являются феномены периодической регуляции метаболической активности. Такая регуляция  возникают  при интенсивном росте клеток с высокой оптической плотностью, который наиболее часто используется в индустриальной микробиологии.  Появление этого феномена  свидетельствует о чрезмерной активности клеток и появлении эффектов overflow. Интересным фактом является   совпадение периодов  изменения СIC и  HMS  с периодами  деления клеток. Однако  в данном случае наблюдается не  частичная синхронизация процесса деления, а частичная синхронизация  биохимической активности клеток.  Этот факт не является общепризнанным, однако он имеет под собой прочное обоснование.  После асинхронного деления  новые бактериальные клетки наследуют все биохимические проблемы родительской клетки  и пул ферментов, который является активным в это время.  Видимо, активизация определенного пула  ферментов  не связана с  возрастом клетки.   Однако он  может быть использован  клеткой  только один раз за клеточный цикл.     

 Установлено, что анализ феноменов кооперативного изменения  осмотического состояния метаболической активности  позволяет в режиме online  и  проводить идентификацию  основных процессов в клетках. Обнаруженные феномены  регуляции  имеют универсальный характер. Воспроизводимые зоны профилей  и точки переключения биохимических процессов присутствовали также  при электрооптических исследованиях роста  клеток Listeria innocua, Lactobacills rhamnosus, Corinobacterium,  Bacillus subtilis, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium bifidum.

 Methods

Электрооптические измерения выполнены на приборе  EloTrace 2.0, Biotronix который обеспечивает непрерывное выполнение четырех базовых операций  с минимальным периодом 6 мин:

·        разбавление входной суспензии с неизвестной оптической плотностью;

·        перенос клеток из среды с высокой электропроводностью в воду с конечной  электропроводностью образца  5± 2 mCm/cm;

·        Измерение электрооптического сигнала  в суспензии с относительной погрешностью от образца к образцу  менее чем 3 %.    

·        Расчет абсолютной величин   СIC  с относительной ошибкой  не более        3 % и HMS с ошибкой не более 1 %.

Детальное описание электрооптических  феноменов, поляризуемости и  их применения для анализа бактериальных клеток  приведено в работах /27,28/.

Основным свойством электрооптической методики измерений является сохранение постоянной величины  СIC и HMS в течение процесса пробоподготовки  и измерения.  С определенной уверенностью можно утверждать, что биохимические параметры бактериальных клеток и  их размеры после переноса  в среду с низкой электропроводностью сохраняются в неизменной “замороженной”  величиной по меньшей мере 15-20 мин.. Это состояние возникает благодаря осмотическому стрессу, который блокирует работу каналов и насосов на мембране.  Метаболическая активность клеток таким образом прерывается, концентрация ионов в цитоплазме и размер клеток сохраняются неизменными. Эти предположения легко проверяются  экспериментально при выполнении серии измерений на одном образце. Измеряемый постоянные уровень  СIC подтверждает стабильность ионного состава цитоплазмы, а  постоянная величина HMS  подтверждает неизменность размера клеток  и отсутствие транспорта через мембрану.

Клетки   Е Coli К 12  и L plantarum культивировались в ферментере   Biostat M, Brown, Germany объемом  3 л. при температуре  360 и перемешивании  180 ppm.

E Coli K 12 культивировались на стандартной  MRS  питательной  среде без коррекции  рН.   L plantarum  культивировались на минимальной солевой среде с  регулировкой  рН на уровне  5.6.

Acknowledgments

 Авторы благодарят сотрудников  TU  Berlin, Germany  и персонально  Dr. Stefan Junne и его коллег  за помощь в выполнении  концентрационных и электрооптических измерений клеток  EColi K12. 

(описание прибора)

 Reference

 Glick,B.R. and Pasternak J.J., Molecular biotechnology , ASM Press, 1998,  589

  1. White D. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes, OUPress, 2006, 656.
  2. Warnecke T., Gill R.T., Organic acid toxicity, tolerance, and production in Escherichia Coli biorefining  application, Microb. Cell Fact. 4,25-30,2005.
  3. Vemuri G.N., Altmant E.at all, Overflow Methabolism in Escherichia Coli  during Steady-State Growth: Transcriptional Regulation and Effect of the Redox Ratio,   Appl Environ Microbiology, 72,5, 3653-3661, 2006.

5.      Stoylov, S.P., Colloids Electro-optics,  Theory, Techniques, Applications, Academic Press, London,  1991, 280.

  1. Bottcher, G.P.F., Theory of electrical polarizability, 1, Academic Press,  NY, 1982, 480. 
  2. Landau, L.D., Liphshitz, E.M., Electrodynamics of  Continious medium, Nauka, Moscow, 1982, 416.
  3. Van de Hulst, Light Scattering by Small Particles, Wiley,  NY,  1957, 321.
  4. Chassangole C./ Noisommit –Rizzi, N., Schmid J.W. et al Dynamic modelling of the central carbon metabolism of Escherichia Coli Biotechnol. Bioeng. 79,53-73,2002
  5. De la Torre, G. and Blumfield V.A., Hydrodinamic properties of complex, rigid  biological macromolecules; theory and application,  Quarterly reviews of biophys, 14, 1, 31-139,1981.
  6. Shchyogolev, S.Y., Khlebtsov, N.G., Bunin, V.D., Sirota, A.I. and Bogatyrev, V.A., Inverse problems of spectroturbidimetry of biological disperse systems with random and ordered particle orientation, Proc. SPIE, 2082, , 167-176, 1994.
  7. Brezgunov V.N. et all,  Determination of cell size distribution by electrooptic technique, Colloid  Journal, 51,842-847, 1989
  8. March J.C., Eiteman M.A., Expression of an anaplerotic Enzyme, Piruvate Carboxylase Improves Recombinant Protein Production in Escherichia Coli, Appl. Environ. Microbiol,68(11)5620-5624,2002.
  9. Farmer W.R., Liao J.C., Reduction of Aerobic Acetate Production by Escherichia Coli, Appl. and Enviroment.Microbiology V63,N8,3205-3210,1977.
  10. Kumary S., at all, Regulation of Acetil Coenzyme A Synthetase in Escherichia Coli,  182,15,4173-4179, 1998.
  11. Eiteman M., Altman M, E, Overcoming acetate in Escherichia Coli  recombinant protein fermentations, Trend in Biotechnology, 24,11, 1-7,2006.
  12. el-Mansi,E.M., Holms W.H., Control of carbon flux to acetate excretion during growth of Escherichia Coli in batch and continious cultures J.Gen. Microbiol.,135,2875-2883,1989
  13. R.G.Kroll,I.R.Booth, The relationship between intracellular pH, the pH gradient and potassium transport in Escherichia Coli,Biochem.J. 216 709-716,1983.
  14. W.Epshtein  Osmoregulation by potassium transport in Escherichia Coli, FEMS Microbiology Letters 39,(1-2),73-78,1986.
  15. H.W. Kreuzer-Martin, J. R. Ehleringer, E.L. Hegg Oxygen isotopes indicate most intracellular water in log-phase Escherichia coli is derived from metabolism, PNAS,| l. 102, 48   17337-17341, 2005
  16. V.Williams,H.Williams, Basic physical chemistry for the life science, W.H.Freeman and Company, San Francisco,1972,600.  
  17. Roe A.J., at all, Perturbation of Anion Balance during Inhibition of Growth  of Escherichia Coli by Weak Acids, J.Bacteriology, 180,4,767-772,1998
  18. Ingram, J. L., Maaloe, O. & Neidhardt, F. C. (1983). Growth of  cells and cultures.    Growth rate as a variable. In Growth of the  Bacterial Cell, 227-315. Sunderland, MA: Sinaur Associates.
  19. G.Gottschalk, Bacterial metabolism, Springer-Verlag, 1979.
  20. Cleman G.L., Strohl W.R.,Acetate Metabolism by Escherichia Coli in High-Cell-Density Fermentation Applied Environ Microbiol. 60,11,3952-3958,1994.
  21. Emmerling, M  Metabolic flux responses to pyruvate kinase knockout in Escherichia Coli,  J.Bacteriology,184, 152-164,2002.
  22. Miroshnikov, A.I. and Fomchenkov, V.M., Electrophysical analysis and separation of cells, Nauka,  Moscow, 1986,184.
  23. Angersbach A., Bunin  V. , Ignatov О. Electrooptical analysis   of bacterial cells,  In: Molecular and Colloidal Electro-optics, Stoylov and Stoimenova Eds., Taylor&Francis, Boca Raton, London, New York, 2006, Chapter 13, pp. 307-326.

Вернуться »

Abercade — Исследования промышленных рынковBiOENGiNEERiNGТРИС