Вы находитесь:

Роль и место концентрирования и очистки в технологической схеме производства биопрепаратов

Типичная схема получения биологических препаратов медицинского назначения показана на рисунке 1. Она включает этапы наработки вирусной суспензии, ее осветления, инактивации вирусов, концентрирования, очистки и выделение антигена, составления вакцины (формулирование продукта), изготовление товарной формы вакцины (целевого продукта).  При этом нас интересует значимость и достижение оптимальности процесса на этапе концентрирования и очистки, который на рисунке выделен красной рамкой.

Рисунок 1 - Типичный биотехнологический процесс изготовления инактивированных вакцин  против вирусных инфекций

Следует отметить место и роль концентрирования и очистки в технологической схеме изготовления биопрепаратов медицинского назначения. Как известно, количество побочных системных эффектов, которые могут развиваться при использовании вакцин для профилактики гриппа, прямо зависит от количества технологических примесей, чаще всего яичного белка (овальбумин) и вирусных эндотоксинов. Поэтому, вакцины нового поколения конструируют из высокоочищенных протективных антигенов вируса, в связи с чем, так важна роль данного этапа. Концентрирование вирусного материала дает возможность достичь снижения дозы и объемов вводимого препарата и повышения его эффективности при вакцинопрофилактике. Важность рассматриваемого этапа доказывает также тот факт, что Food and Drug Administration (FDA) и the European Agency for Evaluation of Medicinal Products (EMEA) устанавливают очень высокие требования безопасности и заставляют даже за счет уменьшения эффективности биопрепаратов осуществлять усовершенствование процессов очистки вирусных вакцин. Таким образом, одним из важнейших этапов технологии производства инактивированной гриппозной вакцины, влияющих на создание безопасного медицинского препарата, является этап очистки и концентрирования.

Для того, чтобы выяснить, какой метод очистки вирусного сбора лучше (хроматография илиультрацентрифугирование) важно посмотреть составляющие процессы методов, их характеристики и сравнение технико-технологических параметров.

Методология этапов концентрирования и очистки с использованием диафильтрации, хроматографии и ультрацентрифугирования описана в приводимых ниже лабораторных и опытно-производственных  регламентах (таблица 1).

Таблица 1 – Регламенты концентрирования и очистки вирусов с использованием диафильтрации, хроматографии и ультрацентрифугирования

Этапы диафильтрации и хроматографии в существующих регламентах производства вакцин
Этапы тангенциальной ультрафильтрации и ультрацент-рифугирования в существующих регламентах производства вакцин
Регламент производства «Вакцина гриппозная хроматографическая инактивированная жидкая». Государственное предприятие по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Пастера
 
Получение концентрата методом ультрафильтрации
Подготовка системы ультрафильтрации
Ультрафильтрацию проводят на модульной пилотной для ультрафильтрации. Мембранная поверхность собирается из расчёта 1м2 на 100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Проводят подготовку ультрафильтрационного оборудования и подсоединение насоса.
Концентрирование ВАЖ
Степень концентрирования определяют, исходя из гемагглютинирующей активности ВАЖ. Гемагглютинирующая активность концентрата должна составлять от 1:4096 до 1:8192 ГЕ/0,2мл. На "вход" системы ультрафильтрации через насос присоединяют ёмкость   с   профильтрованной ВАЖ. Возврат ультрафильтрационной системы с модулем подсоединяют к той же ёмкости. Для дополнительной очистки целесообразно   проводить    5-7 кратную     диафильтрацию     рабочим фосфатным   буферным    раствором   (рН = 7,4+0,2), добавляя его ступенчато или непрерывно в концентраты по ходу проведения процесса. Отфильтрованную жидкость, "фильтрат", не содержащую вирус, собирают в емкость и выливают в канализацию. Время концентрирования 100л ВАЖ при поверхности фильтрации 1м2 составляет 6-7 часов. Работу проводят со спиртовкой и спиртовым факелом.
Используется фосфатный буферный раствор, который готовят согласно отдельной инструкции.
Регенерация фильтров
Систему ультрафильтрации промывают последовательно 10л дистиллированной воды, 5л 0,4% раствора NaOH с последующей отмывкой 10л дистиллированной   воды.   После   отмывки проводят консервацию системы ультрафильтрации, заполняя её 70% раствором этанола. Для расконсервирования систему отмывают 10л стерильного 0,8% раствора хлорида натрия. При падении производительности фильтров в 3 раза их заменяют новыми.
Стерилизующая фильтрация
На "вход" установки с ультрафильтрационным модулем подключают ёмкость с инактивированным гельфильтратом со стабилизатором (моновакциной). "Выход" установки подключают к стерильной ёмкости для   сбора   простерилизованной моновакцины.   Работу   выполняют   со   спиртовкой и горящим факелом. Проводят стерилизующую фильтрацию, постепенно увеличивая давление до "точки пузырька". Появление   пузырьков   воздуха   в   фильтрате   при давлении более низком, чем "точка пузырька", свидетельствует о дефекте мембраны. В этом случае стерилизующую фильтрацию повторяют.
 
Получение гельфильтрата
Подготовка макропористого стекла
Макропористое стекло отмачивают три раза в водопроводной воде, которую заливают в соотношении 2:1 к стеклу, потом   отстаивают   до   оседания стекла и воду сливают. Затем макропористое стекло заливают смесью Комаровского* в объёме, равном объёму стекла, и кипятят на водяной бане 1,5 часа, а потом отмывают   дистиллированной   водой   до нейтральной реакции индикатора. Далее стекло при температуре 18+20С заливают 4% раствором поливинилпирролидона (ПВП) в объёме, равном двум объёмам стекла. Стекло с раствором ПВП энергично перемешивают на качалке в течение 2 часов. Затем раствор ПВП    сливают, а    стекло     осторожно промывают один раз дистиллированной водой объёмом, равным 1/2 объёма стекла. После этого стекло выливают на противень, остаточную жидкость сливают и ставят стекло в термошкаф, где оно высушивается и выдерживается в сухом виде при 1300С в течение 25-30 часов. Затем стекло отмывают   от    излишков ПВП    дистиллированной    водой   до исчезновения окраски раствора. Все операции, начиная с заливки стекла раствором ПВП,    проводят   три   раза. После этого модифицированное стекло заливают дистиллированной водой в объёме, равном двум объёмам стекла, и ставят в кипящую водяную баню на 1,5 часа для стерилизации.
Подготовка хроматографической системы
Колонку заполняют модифицированным макропористым стеклом, стекло в колонке уплотняют путём простукивания колонки, пока не прекратится изменение высоты стекла. Колонка в сборе может   быть простерилизована в автоклаве (температура 1290С; 151987,08 Па) в течение 1-3 часов или 5-8% раствором формалина в течение 24часов. К "входу" колонки    через   насос   присоединяют с бутыль фосфатным буферным раствором, к "выходу" колонки - бутыль для отбора проб. Через колонку с макропористым стеклом пропускают при температуре 18+20С фосфатный буферный раствор со скоростью 0,2-0,4л/м2 в мин до тех пор, пока рН раствора; вытекающего из колонки, не станет равным рН исходного буферного раствора.
Подготовка помещения
Работу проводят в боксовом помещении (2 класс чистоты), которое готовят согласно отдельной инструкции.
Гельфильтрационная очистка на макропористом стекле
К входу колонки через насос     присоединяют ёмкость с концентрированной вирусной суспензией. Объём пробы равен 1/10-1/16 объёма макропористого стекла. Скорость фильтрации 0,1-0,2 л/м2 в мин до тех пор,   пока     ОД254     раствора,    вытекающего   из   колонки,   не   станет возрастать. В процессе пропускания буферного раствора через колонку на "выходе" колонки отбираются пробы объёмом, равным   1/6 объёма концентрата до тех пор, пока ОД254 на выходе колонки не зафиксирует появление    "примесного"    пика.            Колонку    промывают   буферным раствором, пока   ОД254  на выходе   колонки   не   станет   равным   ОД254 буфера. Примеси, выходящие из колонки, обеззараживают хлорамином в   ёмкостях,   добавляя   его   до    разведения   1:100   и    сливают в канализацию.
Контроль
Для контроля на гемагглютинирующую активность отбирают 1мл и проводят   контроль согласно отдельной инструкции.
Пробы с гемагглютинирующей активностью ниже 1:2048/0,2мл считают "обратимым браком" и, объединив, подвергают повторной обработке.
Экспериментально-производственный регламент «Вакцина гриппа культуральная очищенная концентрированная сухая» («ГРИПП – А/В-ВАК»)
 
Этап ультрафильтрации объединенных вирусных сборов и получение концентрата
Фильтрацию проводят в помещении 10 000 (класс С) класса чистоты, в котором установлено стерильное место - шкаф ламинарный с вертикальным потоком воздуха, с соблюдением правил асептики. Рабочий стол в шкафу ламинарном дезинфицируют раствором этилового спирта 70%. Бутыль со стерильной вируссодержащей культуральной жидкости протирают снаружи спиртом и вносят в помещение 10 000 класса чистоты.
Объединенный вирусный сбор подвергают очистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрафильтрации через фильтры МФА-С-0,6-1,5 с помощью плоскорамного модуля. Режим очистки динамический в тангенциальном потоке с удельной производительностью   1,4х10-4 л/см2/мин. Давление над рабочей поверхностью мембраны 0,8-1,0 атм/см2, скорость подачи вируссодержащей культуральной жидкости 0,7-0,9 л/мин.
В емкость для раствора заливают 20 л вируссодержащей культуральной жидкости и плотно закрывают крышку. При помощи гибкого армированного шланга к входному штуцеру емкости для раствора присоединяют перистальтический насос, а выходной штуцер емкости соединяют с входным штуцером фильтродержателя. Емкость для сбора фильтрата подсоединяют к выходу фильтродержателя при помощи силиконового шланга, включают насос и создают в емкости для раствора избыточное давление от 0,2 до 1,0 кгс/см2, контролируя его по манометру.
По окончании фильтрования фильтрат и фильтродержатель со шлангами направляют на обеззараживание раствором.
После очистки проводят концентрирование вируса на мембранах с фильтрующей поверхностью 225 см2 на той же установке. Режим концентрирования динамический, в тангенциальном потоке. Линейная скорость подачи вируссодержащей культуральной жидкости 1,0-1,5 л/мин. Давление на входе не должно превышать давление на выходе более, чем на 0,5 кг/см2.
По окончании процесса фильтрации вируссодержащую культуральную жидкость собирают в бутыль и далее проводят процесс концентрирования. Для концентрирования очищенной вируссодержащей культуральной жидкости в ламинарном боксе собирают модуль, состоящий из перистальтического насоса, емкости для хранения раствора,фильтродержателя, с мембраной (фильтрующая поверхность 225 см2), емкости для сбора фильтрата, и соединительных шлангов. В емкости для раствора, находится 19,8 л вируссодержащей культуральной жидкости. При помощи гибкого армированного шланга к входному штуцеру емкости для раствора присоединяют перистальтический насос, а выходной штуцер емкости соединяют с входным штуцером фильтродержателя. Емкость для сбора фильтрата подсоединяют к выходу фильтродержателя при помощи силиконового шланга, включают насос и создают в емкости для раствора избыточное давление от 0,2 до 1,0 кгс/см2, контролируя его по манометру.  
По окончании концентрирования фильтрат и фильтродержатель со шлангами направляют на обеззараживание дезинфицирующим раствором. Пробы концентрата объединенных вирусных сборов контролируют по показателям: стерильность, специфическая активность и следы формалина.
 
Технологический этапа очистки и концентрирования вируса гриппа птиц
Дифференциальное центрифугирование.Накопленную биомассу вируса в объеме 70 мл в виде ВАЖ осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осаждение вируса проводят при 20 000 об/мин в течение 60 минут на лабораторной центрифуге, температура 4оС. Осадок ресуспендируют в 2-х мл фосфатно-буферного раствора (0,15М NaCI, 0,01М Na2HPO4, 0,01 M KH2PO4 , pH 7,2) и полученную взвесь осветляют центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 15 мин.
Зонально-скоростное центрифугирование.Дополнительную очистку вируса проводят с помощью зонально-скоростного центрифугирования путем наслаивания вирусного концентрата, полученного после  дифференциального центрифугирования на линейный градиент сахарозы (10-30%) и центрифугировали в течение 60 мин при 25 000 об/мин на лабораторной центрифуге, ротор sw 25,1 при температуре 4оС. Фракционирование материала проводят путем прокалывания дна центрифужной пробирки. Объединяют фракции, содержащие 10 000 и более ГАЕ/50 мкл.
В результате получают вирусный концентрат, представляющий собой опалесцирующую жидкость, содержащую 20 000 ГАЕ/50 мкл вируса гриппа птиц типа А, на основе производственного штамма NIBRG-14 (H5N1).
 

Вернуться »

Abercade — Исследования промышленных рынковBiOENGiNEERiNGТРИС