Вы находитесь:

Технологические и технико-экономические параметры методов хроматографии и ультрацентрифугирования для очистки и концентрирования вакцин

Сравнительные аспекты:Значение многоступенчатых  технологических процессов

Типичная технологическая схема очистки и концентрирования включает в себя многочисленные этапы, начиная от исходного необработанного биотехнологическим процессом материала к финальному формулированию (составлению) вакцины из чистого биоматериала. Они включают: начальное осветление, фильтрацию и хроматографические этапы, а также,  как правило, этап смены буфера. Применение ультрацентрифуги KII системы AlfaWassermann не только позволяет исключить использование этих комплексных систем и дорогостоящих матриц для колонок, но также увеличивает выход конечного продукта благодаря минимизации количества этапов, используемых в процессе очистки (см. ниже). Многоступенчатые процессы отрицательно влияют на выход конечного продукта. В таблице 1 показаны сравнительные аспекты систем концентрирования и очистки культуральной вакцины.
 
Таблица 1 – Многоступенчатость обычной системы и минимизация количества этапов при KII ультрацентрифужной системе концентрирования и очистки культуральной вакцины
 
KII ультрацентрифужные системы
Обычные системы
Производство – биореактор, 150 литров
Биореактор
Осветление – очистка и разделение за счет применения KII центрифуги, 3.2 литрового ротора
Концентрирование
Окончательное формулирование вакцины, 10 литров
Диафильтрация 1
 
Хроматография 1
Диафильтрация 2
Хроматография 2
Концентрирование /смена буфера
Окончательное формулирование вакцины
 
Преимущества KII ультрацентрифугирования:
- не нуждается в буфер-обменной диафильтрации;
- нет необходимости в предварительном концентрировании собранного материала;
- осветление (предварительная очистка) возможно с опцией К6 ротора;
- нет необходимости в сменных фильтрах или матрицах для хроматографии;
- единственный этап концентрирования и очистки;
- сохранение (аккумулирование) инфекционности вирусов в нижнем срезе градиента среды;
- выход продукта выше 75-80%
 
Стратегия минимизации количества технологических этапов концентрирования/очистки и повышения выхода продукта представлена на рисунке 1.
Рисунок 1 - Стратегия минимизации количества технологических этапов концентрирования/очистки и повышения выхода продукта
 
Для сценария концентрирования и очистки ультрафильтрацией и хроматографией. Начальные расчетные условия 40 000 куриных эмбрионов – 40 000 доз è окончательный результат – 15 000 доз   (1 доза = 2,6 куриных эмбрионов). Продолжительность процесса = 3 дня.
Для сценария концентрирования и очистки тангенциальной ультрафильтрацией и градиентным ультрацентрифугированием в постоянном потоке. Начальные расчетные условия 40 000 куриных эмбрионов – 40 000 доз è окончательный результат – 31 000 доз   (1 доза = 1,3 куриных эмбриона). Продолжительность процесса = 1 день.
Возможность ускорения технологического процесса очистки и концентрирования при применении ультрацентрифугирования в сравнении с хроматографией показана на рисунке 2.
 
Рисунок 2 - Возможности ускорения технологического процесса на примере
версий хроматографии и ультрацентрифугирования
 
При применении ультрацентрифугирования в сравнении с хроматографией достигается: сокращение технологических этапов => уменьшение потерь продукта => повышение выхода => ускорение технологического процесса с повышением объемов за день => повышение вместимости и производительности => улучшение качества продукта благодаря  уменьшению биовместимости конструкции.
Экономические характеристики сравниваемых методов могут быть представлены упрощенной финансовой моделью, а также цифрами закупок и информацией о применении метода ультрацентрифугирования в производстве вакцин ведущими брендами и странами-производителями. При построении упрощенной финансовой модели для сравнения экономических параметров исследуемых альтернативных производственных технологических практик необходимо учитывать три аспекта. Это, во-первых, разовые первоначальные инвестиции на закупку оборудования для ультрацентрифугирования и хроматографии. Во-вторых, то, что многоступенчатые процессы отрицательно влияют на выход конечного продукта, а это, в свою очередь, отражается на показателях повышения потерь и снижения выхода очищенного вируса для процесса хроматографии (около 37%) в сравнении с ультрацентрифугированием (около 75 %). То есть, двукратное снижение выхода вируса приводит к необходимости двукратного повышения текущих затрат на приобретение куриных эмбрионов (1 доза = 2,6 куриных эмбриона при хроматографии в сравнении с 1 доза = 1,3 куриных эмбриона при ультрацентрифугировании). В третьих, это то, что за счет сокращения продолжительности цикла выпуска вакцины (с хроматографией процесс длится 3 дня, а с ультрацентрифугированием – 1 день) повышается поступление оборотных финансовых средств за счет увеличения объемов продаж. В четвертых, это  использование комплексных систем и дорогостоящих сменных матриц для колонок, требующихся для процессов хроматографии и отсутствие необходимости в их применении для ультрацентрифугирования, что приводит к возрастанию текущих расходов финансовых средств в первом случае.
Таким образом, упрощенная финансовая модель основана:
- на первоначальных разовых инвестициях в приобретение ультрацентрифуги и хроматографической системы, которые в первом случае существенно выше;
- на окупаемости затрат, которая для варианта приобретения ультрацентрифуги будет происходить быстрее. Это связано с более существенным поступление оборотных финансовых средств от реализации продукции, в связи с сокращением продолжительности производственного цикла при такой (ультрацентрифуга) технологической схеме построения производства;
- на уменьшении текущих расходов при получении вирусного сбора благодаря тому, что двукратное повышение выхода продукта позволяет также двукратно уменьшить количество используемых куриных эмбрионов;
- на практически полном отсутствии текущих затрат на расходные материалы в технологии ультрацентрифугирования и существенных затратах на хроматографические матрицы и расходные материалы в технологии хроматографии.
Упрощенная финансовая модель затрат с условными стоимостными параметрами при применении методовхроматографии и ультрацентрифугирования в производстве биопрепаратов показана на рисунке 3.
 
Рисунок 3 – Диаграмма упрощенной финансовой модели сравнения экономических параметров хроматографии и ультрацентрифугирования
 
В качестве подтверждения широкого применения cf-систем ультрацентрифугирования компанииAlfaWassermann для производственного разделения и очистки в различных странах являются данные по закупкам этих систем за последние годы, представленные в таблице 7.
 
Таблица 1 – Данные по закупкам систем cf-ультрацентрифугирования компании Alfa Wassermann различными известными производителями биопрепаратов

 

В Российской Федерации очистка и концентрирование вируса гриппа с помощью седиментации в градиенте плотности сахарозы лежит в основе технологии производства цельновирионных инактивированных гриппозных вакцин.

В выборе способа очистки важно учесть еще несколько моментов и факторов:
- аспект исторически сложившегося мнения о прогрессивности метода. Поверхностный взгляд может привести к выводу, что ультрацентрифугирование для целей очистки уже давно используется и поэтому более прогрессивным способом можно считать хроматографию. Данное мнение является заблуждением, так как совершенствование технических решений технологии ультрацентрифугирования продолжает развиваться;
- предпочтительную расположенность метода к лабораторной или производственной технологии и сложности масштабирования. Сравнение масштабируемости рассматриваемых альтернативных технологий позволяет отдать предпочтение производственному сценарию на основе ультрацентрифугирования ;
- стадию разработки и регистрации препарата. Вполне возможно иметь лабораторный утвержденный регламент на один способ изготовления, а регистрировать фарм-статью опытно-промышленного изготовления – на другой способ;
- заинтересованность в реализации оборудования и лоббирование интереса фирмы-производителя. Здесь достаточно посмотреть сравнительные данные по применению методов и оборудования для концентрирования и очистки вирусных суспензий у ведущих производителей биопрепаратов.
Принимая во внимание совокупность представленной информации и технико-экономические последствия применения основных альтернативных решений в технологиях очистки и концентрирования вирусов при производстве вакцин разработчикам и производителям биопрепаратов следует отдать предпочтение системам cf-систем ультрацентрифугирования.
На основании этого вывода составлено предложение варианта производственного регламента очистки и концентрирования с помощью градиентного ультрацентрифугирования с непрерывным потоком и вертикальным ротором.

 

 Этап концентрирования и очистки вируса гриппа
Предварительное осветление объединенных вирусных сборов и получение концентрата
Объединенный вирусный сбор в объеме 400 литров в виде вируссодержащей аллантоисной жидкости осветляют центрифугированием с использованием ротора К6 (дополнительная опция) ультрацентрифуги КII Альфа Вассерманн в исполнении для GMP и работы в чистых (BSL2+) помещениях. Процесс предварительного осветления проходит при вращении ротора 3000 об/мин в течение 30 минут. В результате первичной очистки получают 400 литров вируссодержащей жидкости, освобожденной от крупных агрегатов субстрата выращивания вируса.
Инактивация вируссодержащего материала
В данном документе не рассматривается.
Концентрирование антигена (нужно ли проводить концентрирование вируссодержащего   материала, если в дальнейшем при очистке ультрацентрифугированием выход продукта составляет выше 80%?).
Первый вариант – концентрирование дифференциальным центрифугированием.
Концентрирование вируса проводят дифференциальным центрифугированием при скорости вращения ротора 20 000 об/мин в течение 60 минут при температуре 4оС. Осадок ресуспендируют с использованием фосфатно-буферного раствора (0,15М NaCI, 0,01М Na2HPO4, 0,01 M KH2PO4 , pH 7,2) и полученную взвесь осветляют центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 15 мин.
Второй вариант.
Для концентрирования вируссодержащей жидкости в ламинарном боксе собирают модуль, состоящий из перистальтического насоса, емкости для хранения раствора, фильтродержателя, с мембраной (фильтрующая поверхность 225 см2), емкости для сбора фильтрата, и соединительных шлангов. Режим концентрирования динамический, в тангенциальном потоке. Линейная скорость подачи вируссодержащей жидкости 1,0-1,5 л/мин. В емкости для раствора, находится 400 л вируссодержащей жидкости. При помощи гибкого армированного шланга к входному штуцеру емкости для раствора присоединяют перистальтический насос, а выходной штуцер емкости соединяют с входным штуцером фильтродержателя. Емкость для сбора фильтрата подсоединяют к выходу фильтродержателя при помощи силиконового шланга, включают насос и создают в емкости для раствора избыточное давление от 0,2 до 1,0 кгс/см2, контролируя его по манометру.   В течение 5-7 часов тангенциальной ультрафильтрацией выполняется 5-кратное концентрирование до получения 88 литров сконцентрированной вирусной суспензии. По окончании концентрирования фильтрат и фильтродержатель со шлангами направляют на обеззараживание дезинфицирующим раствором.
Очистка вируссодержащего материала от овальбумина и бактериального эндотоксина градиентным ультрацентрифугированием в непрерывном потоке.
Ультрацентрифугирование проводят на ультрацентрифуге KII с вертикальным ротором К3 и объемом сепарационной камеры 3,2 литра и силе седиментации 120 000g. Для очистки вируса гриппа используемый седиментационный диапазон составляет 700-900S, скорость потока 22-30 литров/час, градиент плотности сахарозы – 0-45%. В процессе очистки ультрацентрифугированием все вирусные частицы остаются в роторе и разделяются согласно плавучей плотности. Жидкая фаза объемом 88 литров, освобожденная от вирусных частиц из ультрацентрифуги подается к емкости для отходов. Общий объем собранного градиента плотности и частиц в вертикальном роторе составляет 3,2 литра. В нем разделены очищенные вирусные фракции в отдельных зонах градиента. Затем коллектором фракций выполняется фракционирование собранного градиента жидкости и выделение высокоочищенной фракции вируса. Конечный объем продукта после фракционирования составляет 600 мл с 80-90% выходом вируса. Таким образом, целевые вирусные частицы поглощаются в градиенте, а другие загрязняющие вирус примеси выводятся в емкость для отходов.

Пример поточного технологического процесса на основе выращивания вируса гриппа в аллантоисе куриных эмбрионов с учетом предложений по изменению регламента концентрирования и очистки представлен на рисунке 18.

Рисунок 4 – Пример поточного технологического процесса на основе систем cf-ультрацентрифугирования

Таким образом, согласно примеру поточного технологического процесса выращивания вируса гриппа в аллантоисе куриных эмбрионов при использовании оптимальной технологической схемы концентрирования и очистки вакцины для человека на основе тангенциальной ультрафильтрации и градиентного ультрацентрифугирования вируса в непрерывном потоке из 40 000 куриных яиц можно получить «урожай» вируса объемом 400 литров, затем предварительной очисткой - осветленный объем 400 литров, далее тангенциальной ультрафильтрацией - концентрат 88 литров (концентрирование в 5 раз), затем очисткой путем разделения и наслоения вирусной фракции в градиенте плотности вертикального ротора - 3,2 литра сбора и, наконец,  разделением при помощи коллектора фракций - 600 мл конечной очищенной концентрированной вирусной фракции.

Вернуться »

Abercade — Исследования промышленных рынковBiOENGiNEERiNGТРИС