Вы находитесь:

Технология промышленной очистки вакцин с помощью хроматографии

Сценарий получения целевого продукта - выделение, концентрирование и очистка с помощью диафильтрации и хроматографии показаны на рисунке 1.

Рисунок 1 - Сценарии получения целевого продукта - выделение, концентрирование и очистка с помощью диафильтрации и хроматографии

Описание этапов данного сценария выделения, концентрирования и очистки приведено ниже. Поскольку объективность сравнения предполагает рассмотрение последних достижений в области новых технологических решений, поэтому в данном разделе представлено описание последних разработок в области хроматографической очистки белков и биомолекул.
Удаление клеток / Осветление
В современной промышленной биотехнологии культуры клеток и микробное выращивание – основные исходные процессы для производства терапевтических белков. Ключевые технологии, относящиеся к процессам осветления и очистки от клеточных культур и микробного выращивания, главным образом вовлекают фильтрацию и предварительную очистку. Этапы очистки, такие как хроматография являются очень дорогостоящими. Проведение хроматографии  значительно зависит от предшествующего удаления макрочастиц вещества, особенно клеток и клеточного дебриса, так же как коллоидных примесей из ферментационных сред. За последнее время были развиты технологии глубинных фильтров, которые эффективно удовлетворяют этим требованиям, применяя технологию прямого потока. Эффективное удаление клеток и клеточного дебриса зависит от того, как удается конструировать экономичные и надежные системы фильтрации для такого биофармацевтического применения. Технология прямого потока комбинирует превосходный клеточный урожай и способности осветления с самой высокой пропускной способностью ферментационной среды. Носитель фильтра состоит из волокна целлюлозы объединенного с неорганическим фильтром вспомогательного вещества, что предполагает много ценных преимуществ:
- превосходный эффект осветления с самой высокой способностью для задержки частиц и коллоидных примесей;
- уменьшение количества частиц и коллоидных примесей, благодаря высокой способности носителя фильтра к задержанию посредством адсорбции к положительно заряженному носителю  фильтра.
Выделение/Очистка
Хроматография высоко растворимых белков, крупных белков и вирусов
Хроматография является очень важным методом очистки для биофармацевтики. Она обладает высочайшей селективностью в очистке продукта, благодаря заполнению колонки гелевыми гранулами. Хотя хроматографическая колонна эффективна она имеет такие недостатки, как большую продолжительность обработки, величина эффекта разделения зависит от маленького размера пор гранул, а также маленькую пропускную способность -  только 100-150 см/час. Необходимо также иметь осторожность, когда колонки,  восприимчивые к поломке, заполняются гелевым слоем, а также с проводящим каналом и захватыванием воздуха. Наполнение колонки и ее валидация могут отнимать много времени и быть дорогостоящими. Эти факторы, а также высокая стоимость аппаратных средств, чувствительность к очистке и условиям хранения, сложность операций - все это влияет на полную экономику процесса.
Мембранная хроматография
Чтобы преодолеть эти неудобства, было разработано большое число инновационных хроматографических мембран. Химические мембраны включают ионообменники такие как аммоний четвертичный (Q), сульфоновая кислота (S), диэтиламиноэтил (D) и карбоксильная кислота (C), металлическая хелатная имифосная кислота (IDA), и аффинные мембраны, такие как белок A и мембраны для создания собственной  аффинной поверхности, такие как альдегид и эпоксидные мембраны. Эти мембраны имеют макропористую структуру с размером поры > 3 и 0.45 μm, то есть с величиной, большей чем обычные хроматографические гелевые матрицы. Поры позволяют большим молекулам и даже вирусам получить доступ к связывающим участкам в пределах пористой структуры мембранной поверхности при прямой конвекции жидкости, вместо того, чтобы зависеть от распространения и эффекта просеивания маленьких пор в хроматографических смолах. Мембранные адсорбенты добавляют новые варианты в процессы очистки, поскольку их можно быстро приготовить для использования, они полностью масштабируемы, и, годны к употреблению с значительно более высокой скоростью в сравнении с колонками.
Типичные характеристики применения мембранных адсорбентов
- Очистка белков в высоко разбавленных растворах
- Очистка вирусов
- Очистка больших белков
- Высокоскоростная очистка неустойчивых биомолекул
Модули мембранных адсорбентовмогут быть повторно использованы сотни раз. Они сконструированы, чтобы достигнуть высокой способности связывания для больших молекул и вирусов, а также для самой высокой пропускной способности.
Совершенствование удаления загрязнителей хроматографией: ДНК, клеточные белки хозяина, выщелоченный белок А, вирусы эндотоксины
В ходе процесса очистки белков, полученных из биологических источников, разделенных этапом ионообменной хроматографии, достигается удаление загрязнителей, таких как остаточная клеточная ДНК, эндотоксины, белки клеток хозяина, выщелоченный белок A, и случайные и/или эндогенные вирусы. Из-за низких объемных скоростей гелевой колонки, объем слоя явно недостаточен, чтобы достигнуть приемлемого процесса по времени. Такими колонками нельзя управлять экономно в выбранном способе использования и очень необходимы усилия и расход средств, чтобы выполнить регенерацию материала геля. Напротив, адсорбенты мембраны с сильным химическим анионообменником и размером поры > 3 μm, обеспечивают поток до 40 объемов слоя в минуту с устойчивым уровнем связывающей способности для целевых молекул. Для больших белков и биочастиц, таких как вирусы, мембраны не проявляют эффектов исключения размера, что демонстрируется обычными хроматографическими матрицами.
Конструкция капсулы
Внешние элементы похожи на стандартные капсулы фильтра, кроме адсорбционной мембраны, намотанной на сердцевину ядро в форме цилиндра. Из-за цилиндрической конструкции адсорбента, достигается большая площадь мембраны и большая фронтальная поверхность, что приводит к очень высокой пропускной способности и компактному расположению в объеме основания.
Удаление загрязнителей за один этап
Концентрация водородных ионов (рН) буфера выбирается ниже изоэлектрической точки выделяемого белка. Положительно заряженный лиганд Q адсорбента связывает все отрицательно заряженные примеси. Нейтральный и положительно заряженные белки проходят через систему. Типичные объемы "загрузки" между 2- и 10-килограммами белка на литр мембранного адсорбента, намного больше, чем можно достигнуть в процессе обычной колоночной хроматографии. Мембранная хроматография позволяет получать существенные уменьшения многих критических технологических примесей при производстве лекарственных белков.
Наибольший масштаб диапазона
Портфель капсул мембраной хроматографии, основанный на однократном безотходном методе, включают непосредственно в концепцию чертежа в увеличенном масштабе с постоянным основанием и высотой от наименьшего лабораторного диапазона до десяти тысяч литров в производственном масштабе.
Более высокое качество с меньшими затратами
Из-за мембранной структуры, ДНК и вирусное разделение превосходит обычные колонки, которые начиная с определенного размера исключения не применяются. Их пропускная способность выше и введение отрицательного ионнообменнного этапа  сохраняет капитал при инвестициях и уменьшает стоимость обслуживания и нет никакой необходимости в упаковке и повторной валидации. Буферное потребление радикально понижается.
Обработка подобно фильтру
Так как капсулы мембранного адсорбента ведут себя больше как фильтры, чем колонки, то можно избежать комплекса действий, необходимых для  хроматографической колонки. Неподвижное основание капсул не нуждается в дополнительном внимании относительно упаковки, транспортировки, тряски, воздуха, надежности основания или каналов.
 
Здесь необходимо отметить, что приведенные материалы о современных разработках в области хроматографической очистки в основном, по-видимому, связаны с работами по очистке терапевтических белков и в меньшей степени – с белками вирусов (антигенами) или живыми вирусами и убитыми цельновирионными субстанциями. По крайней мере, не удалось найти источников, в которых было бы представлено применение данных технических решений и разработок в виде регламента для производственного выделения и очистки вирусов, и, в особенности, представляющего в настоящее время наибольший интерес - вируса гриппа. Поэтому, в дальнейшем, в качестве объекта сравнения были использованы общепринятые способы очистки вирусов гельхроматографией и ионнообменной хроматографией. 
 
Важным условием при выборе способа очистки и концентрирования является сложность технологического процесса и аппаратурного решения. На рисунках 2 и 3 показано предложение по типичному процессу выделения и очистки с помощью ультрафильтрации и хроматографии. Очевидно, что представленная технологическая схема достаточно сложна в реализации при масштабировании и промышленном производстве биопрепаратов.

 

Рисунок 2 - Предложение по процессу выделения и очистки с помощью ультрафильтрации и хроматографии
 
Рисунок 3 - Описание производства биопродукта на этапах концентрирования и очистки
 
Для проведения концентрирования и очистки методами ультрафильтрации и хроматографии при пилотном или массовом производстве может быть применено следующее оборудование. Небольшая система для ультрафильтрации со спиральным элементом для выполнения пилотных исследований имеет следующие характеристики:
 
Устройство: UF-201 (производство Synder Filtration, США), порционный процесс
Элемент: 1 шт.хPVDF 0.1M-24-CB2319
Площадь мембраны: 0,95 м2
Давление: 2,62 бар на входе/1,72 бар на выходе
Температура подаваемого раствора: 38оС
Изначальный объем раствора: 12 л
Объем фильтрата: 8,5 л
Объем концентрата: 3,5 л
Коэффициент концентрации: 3,429
Время фильтрации: 12,5 мин
Скорость потока: 42,94 л/м2/час
Результаты тестирования: биологическая активность в фильтрате не обнаружена.
 
Установки, позволяющие вывести ультрафильтрацию на промышленный масштаб, имеют следующие характеристики:
 
Процесс: F-211
Элементы: 3 шт.хPVDF 0.1M-46-CBWT8240
Площадь мембраны: 90 м2
Давление: 4,83 бар на входе/1,38-1,15 бар на выходе/элемент
Температура готового продукта: 40оС
Температура микрофильтрации: 37,8оС
Вес концентрата: 9525 кг
Вес готового продукта: 38,44 кг
рН готового продукта: 4,9
Время микрофильтрации: 9,5 час
Коэффициент концентрирования: 4
Скорость потока: 265-284л в минуту
Циркуляция по контуру: 946л в минуту
Поток фильтрата: 38л в минуту
Поток: 33,82 л/м2/час ≈ 812 л/м2/день

 

Рисунок 4 - Промышленные мощности для производственной ультрафильтрации

Рисунок 5 – Производственная мембранная хроматография

Вернуться »

Abercade — Исследования промышленных рынковBiOENGiNEERiNGТРИС